Иголка в стоге сена

Перед биологами и медиками часто встает задача найти среди огромного количества ДНК организма один-единственный ген. Например — вы исследователь, и вам необходимо создать генно-модифицированную бактерию, производящую инсулин для лечения диабета. Или вы — медик, и вам нужно найти ген, характерный для крайне опасного вируса в крови пациента. Проблема заключается в том, что геном человека содержит более 3 млрд. пар оснований (около 750 мегабайт данных), а необходимый ген обычно имеет размер 200–500 пар оснований (50–125 байт). Как же среди этого обилия ненужного для работы мусора найти столь ценный фрагмент?

Сначала — небольшой экскурс в молекулярно-биологическую терминологию:

Комплиментарность — свойство кусочков ДНК (А, Г, Т и Ц — азотистые основания, кодирующие всю информацию в наших генах) подходить друг к другу попарно: А-Т, Г-Ц.

Полимераза — фермент, способный достраивать на одной цепочке ДНК вторую цепочку из плавающих вокруг кусочков (оснований) по принципу комплиментарности.

Праймер — небольшой отрезок ДНК в 20–30 кусочков, комплиментарный началу или концу синтезируемого фрагмента, нужен в качестве «затравки» для полимеразы.

Технология полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет не только найти «иголку в стоге сена», но и превратить эту «иголку» в целый «стог из иголок». Заключается она в том, что с помощью двух небольших молекул (полимеразы, способной достраивать на основе этих молекул весь ген) — праймера и фермента — можно синтезировать огромное количество копий интересующего нас гена.

Кратко схему синтеза можно описать так: мы помещаем в пробирку выделенную из крови (слюны, волос, отпечатков пальцев) ДНК, в которой содержится огромное количество генов как обладателя материала, так и случайно залетевших в пробирку образцов: местных бактерий, тараканов, заползших в лабораторию, сушеного чая из соседней кружки и т.д. Затем мы добавляем те самые праймеры, с помощью которых полимераза сможет синтезировать только нужный нам ген, буферный раствор, необходимый для соблюдения всех тонкостей параметров среды, ионы магния, нужные для работы полимеразы, и, собственно, саму полимеразу, выделенную из бактерий, обитающих в гейзерах, и, таким образом, обладающую (в отличие от человеческой) устойчивостью к высоким температурам.

Далее смесь ДНК разогревается до 96 градусов, благодаря чему двойные цепи ДНК расходятся и «открываются» для реакции, после чего короткие праймеры прикрепляются к характерным участкам в начале и конце нашего гена, а полимераза достраивает их до полноразмерной копии с двух сторон. Таким образом, вместо одной копии гена мы получаем две. Далее с каждым циклом этой операции количество нужных нам фрагментов возрастает в геометрической прогрессии, и уже после двух часов реакции можно поставить еще один эксперимент — засунуть полученную ДНК в агарозный гель (тот самый, из которого делали советский мармелад), и с помощью электрического поля разделить ее по размеру (ДНК обладает зарядом, и, следовательно, движется в электрическом поле, но за счет того, что в геле присутствуют поры определенного размера, маленькие отрезки ДНК проталкиваются через него быстрее, чем большие). С помощью маркеров — смесей ДНК известной длины — можно примерно сказать, какой длины фрагмент мы получили в результате ПЦР, а длина фрагмента является ключевой характеристикой гена, уникальной для большинства ситуаций. Для обнаружения же полосок ДНК в геле используется страшно канцерогенный, но уникальной эффективности краситель — бромистый этидий, связывающийся с ДНК и светящийся в ультрафиолете.

Благодаря всем этим операциям спустя всего два-три часа после сдачи анализа можно с точностью сказать, есть ли в крови несчастного пациента страшный вирус, или же следует искать причину плохого самочувствия в мусоре не генетическом, но психологическом.

Павел Ивашкин